Jan war der Sohn von Balthasar Jesenský, einem slowakischen Adeligen aus der Turz (Ort „Welke Jaseno“, heute Teil von Turcianske Jaseno) im Königlichen Ungarn, der vor den Türken von Buda nach Breslau geflüchtet war.
Jan besuchte das Breslauer Elisabethgymnasium und studierte seit 1583, zunächst in Wittenberg, dann in Leipzig und schließlich 1588 in Padua.
1593 war Jessenius kurze Zeit als Arzt in seiner Geburtsstadt Breslau tätig, dann wurde er zum Leibarzt des sächsischen Kurfürsten Christian II. berufen, und im folgenden Jahr erhielt er die Professur für Anatomie an der Universität Wittenberg. 1600 ging Jessenius nach Prag, wo er die erste öffentliche Autopsie in den böhmischen Ländern durchführte und damit großes Aufsehen erregte. Er war Gelehrter und medizinischer Berater am Hof Kaiser Rudolfs II. und später auch Leibarzt des kränkelnden Monarchen. 1601 hielt er die Leichenrede für den unter nicht völlig geklärten Umständen vorzeitig verstorbenen Hofmathematiker des Kaisers, Tycho Brahe.
Aus seiner hervorragenden Position heraus knüpfte Jessenius vielfältige Kontakte zu bedeutenden Vertretern des böhmischen Herrenstands, so zum Beispiel zu Karl d. Ä. von Žerotín. 1617 wurde er zum Rektor der Karls-Universität Prag gewählt. Er setzte sich dafür ein, dass die seit der Hussitischen Revolution nur ein Schattendasein fristende Akademie wieder zu einer vollständigen Universität ausgebaut würde. 1619 wandte sich Jessenius wegen der Erneuerung der Karls-Universität mit einer Denkschrift an den in Prag versammelten Generallandtag der böhmischen Länder. Im selben Jahr trat er auch in die Dienste des neu gewählten böhmischen Königs Friedrich von der Pfalz.
Jan Jessenius war nicht nur ein bedeutender Mediziner, sondern betätigte sich auf Seiten der protestantischen Stände des Königreichs Böhmen auch als Politiker. Nach dem Prager Fenstersturz wurde er 1618 vom ständischen Direktorium in diplomatischer Mission an den ungarischen Reichstag gesandt. Ferdinand II. ließ ihn danach in Preßburg als Rebellen verhaften und ins Gefängnis nach Wien bringen. Im Dezember wurde er aber im Austausch gegen zwei Habsburg-Anhänger, die in Prag einsaßen, freigelassen.
Nach einer Legende hinterließ Jessenius in seiner Wiener Zelle die Inschrift IMMMM an der Wand. Ferdinand deutete dies als Imperator Matthias Mense Martio Morietur (deutsch: Kaiser Matthias wird im Monat März sterben), was im Folgejahr tatsächlich geschah. Der Habsburger fügte eine zweite Deutung hinzu: Iesseni Mentiris Mala Morte Morieris (deutsch: Jessenius, du lügst und wirst eines schrecklichen Todes sterben). Diese Prophezeiung erfüllte Ferdinand selbst, indem er Jessenius nach der Niederlage des böhmischen Ständeaufstands auf dem Prager Altmarkt enthaupten ließ.