Rita Levi-Montalcini und ihre Zwillingsschwester Paola entstammen einer sephardischen Familie. Ihre Eltern waren der jüdische Ingenieur und Mathematiker Adamo Levi und seine Frau Adele Montalcini. Zur Familie zählten auch ihr Bruder Gino (* 1902) und die Schwester Nina (* 1904). Als ihr Kindermädchen Giovanna unheilbar an Krebs erkrankte, beschloss die 19-jährige Rita Levi, Medizin zu studieren. 1936 beendete sie ihr Medizinstudium. Da Mussolini sogenannten "nichtarischen" Frauen den Zugang zu akademischen Positionen verweigerte, zog sie nach Belgien. Kurz vor der deutschen Invasion kehrte sie nach Italien zurück, wo sie unter anderem in ihrem Schlafzimmer weiterforschte. Zwischen 1943 und 1945 lebte sie illegal in Florenz.
Nach Kriegsende kämpfte sie in Flüchtlingslagern gegen Seuchen und Epidemien. Von 1969 bis 1979 leitete sie u. a. in Rom das Laboratorium für Zellbiologie des Nationalen Forschungsrates. Ihre Forschungsarbeit konzentrierte sich auf zelluläre Nachrichtenübertragung und Steuerungsmechanismen des Zell- und Gewebewachstums. Sie entdeckte den Epidermal Growth Factor (EGF), den Nervenwachstumsfaktor (NGF), ein Polypeptid, und prägte zusammen mit Viktor Hamburger den Begriff „Neurotrophin“. Für die Isolierung und Charakterisierung des Nervenwachstumsfaktors wurde sie mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Sie ist Mitglied der Accademia Nazionale dei Lincei, Rom. Im August 2001 wurde sie von Staatspräsident Carlo Azeglio Ciampi zur Senatorin auf Lebenszeit ernannt. Im Jahr 2006 sollte sie die konstituierende Sitzung des Parlaments als Alterspräsidentin leiten. Sie verzichtete zu Gunsten von Oscar Luigi Scalfaro auf diese Ehre. 2008 verzichtete sie erneut darauf.
Ihre Zwillingsschwester Paola (1909–2000) war eine erfolgreiche Künstlerin.
Seit dem Tode Joseph Rotblats 2005 ist Levi Montalcini die älteste lebende Person, die einen Nobelpreis trägt. Seit dem 4. Mai 2008 ist sie zudem der älteste Nobelpreisträger überhaupt, bislang hatte Tadeusz Reichstein diese Position inne. Seit dem 22. April 2009 ist sie die erste Person, die einen Nobelpreis gewann und mindestens 100 Jahre alt geworden ist.